Riassumendo: rientrano nel primo tipo tutti quei metodi che consentono di ottenere una determinata informazione sperimentale senza ricorrere all'utilizzazione di animali; nel secondo tipo i metodi idonei ad ottenere livelli comparabili di informazione utilizzando un minor numero di animali, nonché quelli che consentono di ricavare il massimo numero di informazioni con un solo saggio su animali; rientrano, infine, nel terzo tipo tutte le metodologie idonee ad alleviare sofferenze e danni imputabili alle pratiche sperimentali. Con maggior precisione, si rileva che all'interno della prima categoria menzionata, si è soliti distinguere tra "metodi sostitutivi biologici" e "metodi sostitutivi non biologici", laddove i primi si riferiscono ai cosiddetti "metodi in vitro", ed utilizzano materiale biologico di diverso tipo (di origine animale o umana); mentre i secondi si avvalgono dei contributi di scienze quali la matematica, l'informatica, la statistica, eccetera.
Prima di procedere all'analisi delle varie metodologie, possono essere utili alcune precisazioni. Merita, infatti, di essere sottolineato l'antitetico approccio sviluppato nei confronti delle metodiche oggetto di questo paragrafo, da parte degli operatori afferenti specialmente al campo biomedico. Accanto a coloro che, prevalentemente sulla spinta di legislazioni tese al conseguimento del cosiddetto "benessere animale" (ma, talvolta, anche per personali convinzioni etiche), sposano il concetto sopra definito delle "3R", tendendo quantomeno alla riduzione della sofferenza degli esseri animali impiegati ; si pongono quegli studiosi (chiamati "animalisti" dagli appartenenti alla prima categoria) per i quali una questione etica potrebbe porsi solo nel caso in cui i metodi che implicano in qualsiasi modo l'utilizzo di animali o loro parti fossero da ritenere scientificamente validi. Concetto questo da essi decisamente rifiutato. Difatti, premettendo che solo l'uomo può costituire un valido modello per l'uomo (così come il topo per il topo, la scimmia per la scimmia, etc.), i cosiddetti "animalisti", per lo più aderenti al "Comitato Scientifico Antivivisezionista" , escludono ogni metodologia che coinvolge animali, ivi inclusi quei metodi in vitro su cellule, tessuti, o organi di una specie differente da quella umana, qualificando come "sostitutivi" (e non "alternativi") i metodi che utilizzano materiale umano così come i predetti metodi non biologici. Indipendentemente dagli aggettivi, un nuovo approccio sperimentale, per essere considerato alternativo alla sperimentazione animale tradizionale, deve essere riproducibile, affidabile, rapido e non più costoso di quello che si vuole sostituire . Il centro europeo preposto alla verifica del rispetto dei suddetti parametri da parte del nuovo metodo (cosiddetta "validazione") è l'ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods), istituito dalla Commissione Europea nel 1991 su proposta del Parlamento dell'Unione, nell'ambito del "Joint Research Centre" di Ispra in provincia di Varese (297). Tra i compiti attribuiti ad ECVAM si ricorda quello di coordinare la validazione dei metodi alternativi a livello comunitario, nonché di costituire un punto di riferimento per lo scambio di informazioni sullo sviluppo dei metodi medesimi, attraverso una banca dati dei metodi disponibili (già validati o in corso di validazione) impostata e gestita dal centro medesimo.
Entrando nel merito del processo di validazione si precisa che attraverso esso viene stabilità l'affidabilità e la rilevanza di un metodo. L'affidabilità descrive la riproducibilità dei risultati nel tempo e nello spazio, cioè, nello stesso laboratorio e tra laboratori diversi (cosiddetta "standardizzazione"); la rilevanza, viceversa, descrive la misura dell'utilità e della significatività del metodo per un determinato scopo. I test di validazione sono molto lunghi (possono durare anche anni) ed hanno lo scopo di verificare se un nuovo metodo fornisce, per determinate sostanze, risultati simili a quelli in precedenza ottenuti attraverso la sperimentazione sugli animali. L'approdo finale di un nuovo metodo è il suo accoglimento entro la regolamentazione internazionale, il che significa l'introduzione dei test alternativi nelle linee guida dell'OECD (Organization for Economic Cooperation and Development). Quest'ultimo, infatti, è un organismo che raccoglie non solo i paesi membri dell'Unione Europea ma anche Stati Uniti, Giappone ed altri; ha il compito di armonizzare i differenti protocolli sperimentali, recependoli sotto forma di linee guida. Le linee guida dell'OECD vengono periodicamente modificate per adeguarle alle nuove conoscenze scientifiche nonché alle modifiche legislative eventualmente intervenute (come avvenne, ad esempio, in seguito all'adozione della Direttiva 86/609/CEE).
Riprendendo la distinzione tra "metodi biologici" e "metodi non biologici", cercherò di spiegare le tecniche di ricerca che appartengono alle suddette categorie.

I "metodi biologici"
Ho già accennato che in essa sono ricompresi tutti i cosiddetti "metodi in vitro". Esistono due metodi per studiare in vitro, parti di organismi viventi: 1) il mantenimento in vitro; 2) la coltura in vitro.
Il mantenimento in vitro consiste nell'estrarre dall'animale (umano o non umano) la parte che interessa (frammenti di tessuto, organi, interi apparati) e mantenerli in condizione di sopravvivere ma non di riprodursi. Se si tratta di frammenti di tessuto, si procede alla loro immersione in una soluzione acquosa, ricca di sali minerali (la cosiddetta "soluzione fisiologica"; se si lavora su organi interi o apparati, non è sufficiente immergerli in soluzione fisiologica ma occorre che quest'utlima raggiunga anche le cellule centrali alla struttura (al fine di evitare che muoiano), procedendo alla cosiddetta "perfusione".
La coltura in vitro consiste nel prelevare piccole parti di tessuto e porlo, immediatamente, in un ambiente idoneo non solo alla sopravvivenza delle cellule ma anche alla loro riproduzione . La coltura in vitro può essere una "coltura cellulare" (che dà luogo a "colonie" di un solo tipo di cellule) o una "coltura tessutale" (che prevede lo sviluppo di due o più tipi di cellule, uniti tra loro in una struttura simile a quella del tessuto di origine). Ovviamente perché cellule e tessuti sopravvivano e si riproducono occorre che siano immersi nel cosiddetto "terreno di coltura", regolarmente alimentato con adeguate sostanze, nonché periodicamente sostituito da terreno fresco, qualora il precedente abbia esaurito tutte le proprie sostanze nutritive, divenendo sterile. Il passo successivo alla coltura di tessuti è rappresentato dalla coltura di organi isolati. In questo caso, se non si procede su animali (uccisi in modo non cruento) ma si intende lavorare su organi umani, ci si deve rivolgere alla sala operatoria o sperare in una donazione post mortem degli organi non idonei ad essere trapiantati . Comunque reperiti, l'utilità di organi umani si rivela da anni un valido aiuto soprattutto in campo oncologico .

I "metodi non biologici"
Epidemiologia e statistica: si tratta di due discipline differenti che, nella pratica, presentano molti punti di contatto. In particolare si può dire che nessuna ricerca epidemiologica può prescindere dalla presentazione di una accurata analisi statistica dei dati raccolti mediante l'osservazione. L'epidemiologia può essere definita come la scienza che studia la frequenza e la distribuzione dei fenomeni epidemici (e, quindi, delle malatte) nella popolazione ; laddove la statistica è quella disciplina che riguarda il trattamento dei dati numerici che derivano da un gruppo di individui (spesso relativamente ad una determinata malattia in riferimento ad una certa zona) . In sintesi, la parte epidemiologica consiste nella selezione di due gruppi di persone che differiscono per una certa caratteristica (ad esempio, l'abitudine al fumo); successivamente, mediante analisi statistiche si valuta se la caratteristica in questione può essere correlata con un'altra caratteristica (ad esempio, la capacità di sviluppare tumori polmonari) . Per poter compiere studi mediante il metodo descritto, idonei a fornire risultati significativi, bisogna poter osservare un grande numero di persone, dal che consegue che tale metodo dura diversi anni; banche dati: è difficile considerare le banche dati dei metodi scientifici in senso stretto, perché non sono metodi di ricerca ma metodi di archiviazione di dati ottenuti nelle ricerche. Creare banche dati vuol dire far afferire ad un centro di raccolta tutti i risultati delle ricerche compiute in un determinato campo. Ciò si ottiene collegando tra loro i computer dei diversi centri di ricerca, in modo che ogni ricercatore possa, in ogni momento, consultare i dati e i risultati di precedenti ricerche, onde evitare inutili ripetizioni;
Computer: la creazione degli elaboratori elettronici ha rappresentato una delle scoperte tecnologiche più importanti e utili del nostro tempo. Anche nel campo della ricerca scientifica l'avvento dei computer ha permesso di velocizzare le procedure. Tutti i dati degli esperimenti vengono archiviati nei computer e analizzati mediante procedure matematiche e statistiche, i cui risultati saranno espressi in numeri, grafici o parole. Da quanto detto si capisce che questi strumenti tecnologici raprresentano il cardine di tutte le metodiche fino ad ora descritte. Non si può però tralasciare di riferire a proposito dei cosiddetti "simulatori computerizzati". Si tratta di computer analogici con applicazioni e potenzialità diverse rispetti ai precedenti. Nel campo della ricerca vengono infatti impiegati nella simulazione di procedimenti metabolici e funzionali del corpo umano (uno dei campi di maggiore applicazione è quello delle ricerche cardio-circolatorie). Attualmente i dati sul funzionamento del corpo umano a nostra disposizione sono moltissimi, così che inserendoli in un computer analogici possiamo ricreare una situazione quasi identica a quella che troveremmo nella realtà. Con questo metodo è possibile monitorare anche le interazioni tra i diversi organi e tessuti, che con i metodi biologici precedentemente riferiti non saremmo in grado di valutare;
Modelli matematici e meccanici: anch'essi ricollegati alla computerizzazione. Mediante i dati ottenuti dall'osservazione clinica oppure dalle analisi di laboratorio si formula un modello matematico che, successivamente, potrà essere trasformato in un modello meccanico (ad esempio, un manichino). Oltre ai già citati modelli cardio-circolatori, in grado di simulare infarti, difetti congenici, risultati di interventi chirurgici, eccetera, ne esistono altri relativi ai sistemi respiratorio e urinario. Un esempio può essere quello di Harvey, un simulatore computerizzato di patologie cardiovascolari presentato dalla Farmitalia Carlo Erba il 14 maggio 1992, a Milano. Harvey è un manichino in lattice in grado di simulare le manifestazioni cliniche di ventisei differenti cardiovasculopatie, consentendo di rilevare la pressione arteriosa, le pulsazioni delle carotidi, ed altri sintomi delle ventisei patologie in grado di simulare . Altri modelli famosi sono quelli utilizzati nella simulazione di incidenti automobilistici: il manichino viene posto sul sedile della macchina che viene lanciata a velocità variabile contro un muro o un altro autoveicolo. Le lesioni riportate dal manichino vengono valutate per migliorare la sicurezza delle automobili .

Come è facile intuire, i metodi descritti in questo paragrafo non esauriscono le alternative alla sperimentazione animale. in questa sede, tuttavia, si è preferito tralasciare le analisi chimiche, la farmacologia quantistica e tutte quelle tecniche non accessibili a coloro che non operano nel settore della ricerca scientifica.